Peter Parker (Tobey Maguire) conseguiu encontrar um meio-termo entre seus deveres como o Homem-Aranha e seu relacionamento com Mary Jane (Kirsten Dunst). Porém o sucesso como herói e a bajulação dos fãs, entre eles Gwen Stacy (Bryce Dallas Howard), faz com que Peter se torne auto-confiante demais e passe a negligenciar as pessoas que se importam com ele. Porém a situação muda quando ele precisa enfrentar Flint Marko (Thomas Haden Church), mais conhecido como o Homem-Areia, que possui ligações com a morte do seu tio Ben. Tendo que lidar com o sentimento de vingança, Peter passa a usar um estranho uniforme negro, que se adapta ao seu corpo.

Após derrotar o Duende Verde a vida de Peter Parker (Tobey Maguire) muda por completo. Temendo que Mary Jane (Kirsten Dunst) sofra algum risco por ser ele o Homem-Aranha, Peter continua escondendo o amor que sente e se mantém longe dela. Ao mesmo tempo precisa lidar com Harry (James Franco), seu melhor amigo, cuja raiva pelo Homem-Aranha aumenta cada vez mais por considerá-lo como sendo o assassino de seu pai. Além disso sua tia May (Rosemary Harris) passa por uma fase difícil após a morte de seu tio Ben, estranhando também o comportamento do sobrinho. Enquanto precisa lidar com seus problemas particulares Peter recebe ainda uma má notícia: o surgimento do Dr. Octopus (Alfred Molina), um homem que possui tentáculos presos ao corpo.

Peter Parker (Tobey Maguire) é um jovem estudioso que vive com seus tios, Ben (Cliff Robertson) e May (Rosemary Harris), desde que seus pais faleceram. Inteligente e com um grande interesse pela ciência, Peter tem dificuldade em se relacionar com seus colegas, por ser tímido e por eles o considerarem um nerd. Até que, em uma demonstração científica, um acidente inesperado faz com que aranha modificada geneticamente pique Peter. A partir de então seu corpo é quimicamente alterado pela picada da aranha, fazendo com que Peter possa escalar paredes e tetos, emitir pelos punhos um fluido ultra-resistente semelhante à uma teia de aranha e passe a ter um "sentido de aranha", que o avisa sempre que há perigo por perto, além de superforça e visão ampliada. Inicialmente Peter pensa em usar seus novos poderes para ganhar dinheiro, adotando o nome de Homem-Aranha e se apresentando em lutas de exibição. Porém, ao permitir que um ladrão fuja por não considerar sua função capturá-lo, o fugitivo acaba assassinando seu tio Ben. A partir de então, Peter decide não mais usar seus poderes para proveito próprio e sim para enfrentar o mal, tendo como seu primeiro grande desafio enfrentar o psicótico Duende Verde (Willem Dafoe), que na verdade é o empresário Norman Osborn após ter sido exposto à um gás experimental que lhe deu uma segunda personalidade e grande força física.